RNA甲基化是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也是高分文章的寵兒，目前大熱點(diǎn)有m6A、m5C、m1A RNA甲基化，尤其m6A修飾熱度只增不減，那么，本期我們繼續(xù)m6A。這次分享的文章是發(fā)表在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”，文章是關(guān)于造血干細(xì)胞（HSC）的研究，也關(guān)于m6A，主角分子依舊是Mettl3蛋白。

本文所有圖片及數(shù)據(jù)均來源于：Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

研究背景：造血干細(xì)胞（HSCs）維持平衡的自我更新和分化，但這些功能如何被精確調(diào)節(jié)尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成為影響許多生物過程中轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)調(diào)控的重要模式?；谶@些，作者開展了實(shí)驗(yàn)。利用Lysm-cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)小鼠Mettl3條件敲除后，髓系細(xì)胞的數(shù)量和功能并未被影響HSCs分化受阻。Myc的轉(zhuǎn)錄本是m6A最主要修飾靶基因，對(duì)HSC細(xì)胞進(jìn)行MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)，Mettl3缺失的HSC細(xì)胞中，MYC的表達(dá)量下降，挽救實(shí)驗(yàn)中增加分化刺激因素或者人為上調(diào)表達(dá)MYC基因，都可以使得挽救HSC的分化功能缺陷。

研究結(jié)果：

1、Mettl3蛋白敲除后HSC細(xì)胞大量堆積

根據(jù)已有研究報(bào)道，HSCs可以直接產(chǎn)生血小板，通過腹膜注射pIpC到敲除Mettl3的Mx1-cre中，通過全血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示Mx1-cre中血小板計(jì)數(shù)顯著降低；Mettl3^fl/fl小鼠與pIpC處理的對(duì)照相比，白細(xì)胞計(jì)數(shù)也顯著降低且分布改變，這表明m6A與造血功能相關(guān)；在pIpC最后一次注射，10天時(shí)，Mettl3的缺失導(dǎo)致髓系細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，脾細(xì)胞無變化；注射后2-4個(gè)月，除髓系細(xì)胞的數(shù)量顯著減少之外，脾臟大小及細(xì)胞構(gòu)成反而增加；在骨髓中，LSK和HSCs在檢測的時(shí)間點(diǎn)都有增加，且HSCs在最后一次pIpC注射后10-14天到4個(gè)月持續(xù)增加，而LSK只是略有增加；另外，觀察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核細(xì)胞和CD41巨核細(xì)胞與對(duì)照相比顯著增加。所有相關(guān)數(shù)據(jù)表明Mettl3的喪失導(dǎo)致HSC細(xì)胞堆積，并且影響巨核細(xì)胞譜系。

2、Mettl3蛋白缺失阻礙HSCs正常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠，檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Mettl3^fl/fl小鼠與對(duì)照相比，BrdU摻入并沒有大的差異，但是細(xì)胞死亡顯著增加；另外，使用5-氟尿嘧啶處理pIpC注射的Mx1-cre小鼠時(shí)，Mettl3^fl/fl小鼠的存活率低于對(duì)照組；這說明HSCs的積累可能是分化受阻而非自我更新增強(qiáng)。而后作者進(jìn)一步利用甲基纖維素檢測HSCs的分化能力，與對(duì)照相比，喪失Mettl3的HSCs形成集落更少且菌落更小，作者利用流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞是不能分化的；但是，當(dāng)Mettl3缺陷的髓系細(xì)胞接種到甲基纖維素中時(shí)，與對(duì)照相比，形成的集落在數(shù)量，大小和類型上相似，且這些菌落含有正常數(shù)量的分化細(xì)胞。這表明Mettl3的缺失導(dǎo)致HSCs的分化受阻，但在體外限制性祖細(xì)胞中不存在此現(xiàn)象。

3、Mettl3是HSCs分化過程的必需分子

為了測試Mettl3的缺失是否導(dǎo)致體內(nèi)HSCs缺陷，作者通過利用Mx1-cre的500,000個(gè)髓系細(xì)胞進(jìn)行競爭性重組測定。 發(fā)現(xiàn)HSCs水平有降低趨勢；作者將Mettl3缺陷型和對(duì)照HSCs以及野生型競爭性髓系細(xì)胞分選出來，并移植到致死量照射的小鼠中，移植對(duì)照HSCs的受體鼠能夠重組主要造血譜系，但缺乏Mettl3的HSCs不能重組，缺陷主要發(fā)生在骨髓和B譜系中，且缺乏Mettl3的HSCs在自我更新上基本是正常的，但是隨著分化層次推移，所分化的造血細(xì)胞逐漸減少；這表明Mettl3缺陷型HSCs在造血重組方面存在缺陷，且Mettl3是HSCs分化過程的所必需的。

4、骨髓細(xì)胞生成不需要Mettl3

作者在Lysm-cre中敲掉Mettl3蛋白，6-8周齡的鼠各細(xì)胞參數(shù)正常（外周血、骨髓、脾細(xì)胞等參數(shù)），且都可以形成正常形態(tài)的巨噬細(xì)胞；當(dāng)受到脂多糖攻擊時(shí)，顯示出的炎性細(xì)胞因子Tnfa，Il1b和Il6均正常上調(diào)；Mettl3缺陷型骨髓細(xì)胞也顯示出強(qiáng)烈的吞噬活性，這個(gè)現(xiàn)象與對(duì)照相似；這說明Mettl3不是成熟骨髓細(xì)胞維持功能所必需的，但HSCs在體內(nèi)造血分化期間對(duì)Mettl3和m6A的階段特異依賴。

5、鑒定HSC中與m6A作用的靶基因

利用MeRIP-seq技術(shù)鑒定，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照小鼠中，富集了2073個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在Mettl3缺陷型HSCs的Mx1-cre中，經(jīng)過pIpC處理10天，只富集了995個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與對(duì)照相比，顯著降低；這說明m6A修飾與Mettl3蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。此外，Myc, Junb 和 Tet2被認(rèn)為是m6A修飾的主要靶基因，在Mettl3缺陷型HSCs中，這些基因的表達(dá)量也下調(diào)。

6、Mettl3介導(dǎo)的m6A會(huì)改變HSCs特性

作者在Mettl3缺陷型HSCs中找到384個(gè)上調(diào)基因，其中95個(gè)是m6A靶標(biāo)，將基因分為m6A靶基因和非m6A靶基因，通過MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)與非m6A靶標(biāo)相比，m6A靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄物在Mettl3缺陷型HSC中具有略微增加的豐度，根據(jù)已有研究報(bào)導(dǎo)，在HSC中MYC蛋白水平非常低，在通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行分化后被上調(diào)，MYC的缺失阻斷HSCs分化，而更高水平的MYC蛋白可以促進(jìn)HSCs分化，這個(gè)現(xiàn)象與Mettl3缺陷型HSCs的表型相似，因此，作者進(jìn)一步通過MeRIP-seq技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)Mettl3缺陷型HSCs中MYC轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有顯著變化，但是，GSEA基因富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mettl3缺陷型HSCs中Myc-靶基因特征的顯著降低，表明m6A可能主要調(diào)節(jié)Myc mRNA翻譯，進(jìn)一步在MYC蛋白中插入GFP蛋白，用來檢測MYC蛋白表達(dá)量，結(jié)果：Mettl3的缺失導(dǎo)致HSCs中MYC-GFP的表達(dá)顯著降低，在激活HSCs分化后，對(duì)照HSCs的MYC-GFP表達(dá)上調(diào)，而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP表達(dá)不能上調(diào)，這說明m6A是HSC中Myc mRNA翻譯所必需的，特別是在分化后。并且將Myc強(qiáng)制表達(dá)可以挽救由Mettl3缺失引起的HSCs分化缺陷。

文章總結(jié)：利用Lysm-cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)小鼠Mettl3條件敲除后，髓系細(xì)胞的數(shù)量和功能并未被影響，但HSCs分化受阻；Myc的轉(zhuǎn)錄本是m6A最主要修飾靶基因，對(duì)HSC細(xì)胞進(jìn)行MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)，Mettl3缺失的HSC細(xì)胞中，MYC的表達(dá)量下降，挽救實(shí)驗(yàn)中增加分化刺激因素或者人為上調(diào)表達(dá)MYC基因，都可以使得挽救HSCs的分化功能缺陷；Mettl3所介導(dǎo)的m6A是HSCs分化過程中所必須的。